肿瘤标记物（Tumormarker）是肿瘤细胞产生的，含量远高于正常细胞的特异性物质。癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen，CEA）是一种参与细胞粘附的糖蛋白，通常是在胎儿发育过程下面是小编为大家整理的2023年抗疫交流材料【五篇】,供大家参考。
抗疫交流材料范文第1篇
关键词 癌胚抗原；
金属有机骨架材料；
电化学免疫传感器
1 引 言
肿瘤标记物（Tumor marker）是肿瘤细胞产生的，含量远高于正常细胞的特异性物质。癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen， CEA）是一种参与细胞粘附的糖蛋白，通常是在胎儿发育过程中产生。1965年，Gold等从结直肠腺瘤和胎儿肠中首次分离出CEA[1]。在健康成年人血清中，CEA含量通常很低，在正常组织中，CEA主要分布在胃肠道上皮细胞中。在肿瘤组织中，CEA不仅在结直肠癌中表现出来[2]，而且在其它类型的癌症，如胃癌[3]，肺癌[4]、乳腺癌[5]、甲状腺癌[6]等癌症中也表现出来。因此癌胚抗原成为目前公认的一种肿瘤标志物，它的临床检测在评估病变范围、预测疗效、监测复发等方面具有较高参考价值[7]， 检测CEA有助于提高肿瘤患者的诊断率，监测肿瘤早期转移，并可为患者根治性手术后是否进行辅助化疗、疗效判断、复发转移等具有一定的指导意义，对患者的病情预后判断有着至关重要的临床意义[8]。常用的CEA的检测方法有实时荧光极化免疫测定法（FPIA）[9]、酶联免疫吸附测定法（ELISA）[10]、放射免疫测定（RIA）[11]、免疫金标技术[12]等方法。但是，荧光免疫测定法的应用范围比较窄，仪器成本较高，而酶联免疫吸附测定法灵敏度不高，放射免疫分析法自身存在放射污染，免疫金标技术法操作较复杂[13]。这些传统方法需要具有专门技术的操作人员，限制了这些方法在普通实验室的应用，难以实现快速检测。电化学免疫传感器由于具有操作程序简单、易于集成化、灵敏度高、成本低等优点， 已广泛应用于肿瘤标记物的检测。随着电化学免疫传感器的日趋成熟， 现代检测技术也将向微型化、集成化的方向发展[14]。
近年来，性能优良的新型金属有机骨架材料（anic frameworks，MOFs）成为研究者关注的热点[15]。
Cu.MOF由苯环有机连接体和含Cu2+的金属羧酸配合物团簇组成，含有四方形配位结构，是一类比表面积大，且具有纳米级规整孔道结构、呈多维网状结构的多孔材料[16]。这种材料的优良特性促使其迅速发展， 并成为材料、化学、环境领域的研究热点，在氢气储备、催化反应、气体吸附与分离及电化学传感器等应用领域有着广阔的研究和应用前景[17，18]， 其结构如图1所示。Cueto等[19]以对苯二甲酸和Cu（NO3）2合成了Cu（tpa）・3（H2O） （Cu.TPA），由于其合成方法与MOF.2[20]相似，所以结构类似于MOF.2（Zn.BDC），是一种多孔四方锥形材料，但其性质有异于MOF.2。Cu.TPA表现出更高的表面积，它在气体分离和存储和以及催化方面具有较高的应用价值[21]。
虽然金属离子已被用作信号标记物，但制备过程普遍费时，如Gao等[22]利用Cu2 +作为标记物检测树状大分子聚合DNA的电化学信号。本研究表明，Cu.TPA材料中的Cu2+氧化还原峰比较稳定，可单独作为一个信号基团，因此将这种Cu.TPA材料用作信号探针，Cu2+的电化学信号可以在缓冲溶液中很容易地检测出来。此新型信号探针不同于传统的探针，它不需要用酸溶解富集进行检测，因此极大地简化了检测步骤。此外，由于金属纳米颗粒可以很容易掺入MOFs中，使得随后偶联抗体的步骤也较简单稳定。鉴于这种信号探针的独特的性能，用其构建新型CEA电化学传感器对于肿瘤的早期诊断具有重要意义。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Cu（NO3）2・3H2O（天津市风船化学试剂科技有限公司）；
对苯二甲酸（C 8H 6O4，萨恩化学技术（上海 ）有限公司）；
N，N.二甲基甲酰胺（DMF，西陇化工有限公司）；
CEA酶联免疫（ELISA）试剂盒及纯化CEA抗体（anti.CEA）购于郑州博赛生物技术股份有限公司；
牛血清白蛋白（BSA，美国Sigma.Aldrich公司）；
氯金酸（HAuCl4，昆明铂锐金属材料有限公司）；
冰醋酸（CH3COOH，成都化学试剂厂）；
醋酸钠（CH3COONa， 麦克林试剂有限公司）；
无水乙醇（成都格雷西亚化学技术有限公司）；
所有试剂均为分析纯，所用水为去离子水。
JEM.2100透射电镜仪（TEM，日本电子株式会社）；
S.3000N扫描电子显微镜 （SEM， 日本Hitachiscience Systemsltd公司）；
DX.2700X射线粉末衍射仪 （丹东方圆仪器有限公司）；
CHI660D电化学工作站（上海辰华公司）。实验中采用三电极体系。
2.2 实验方法
2.2.1 Cu.TPA材料的合成 参照文献[21]合成Cu.TPA。将0.5265 g Cu （NO3）2・3H2O和0.724 g对苯二甲酸溶解在43.5 mL N，N.二甲基甲酰胺中，溶液变成蓝色；
将所得溶液转移到高压反应釜中，于110℃下反应36 h，自然冷却，用无水乙醇洗涤3次，于80℃真空干燥12 h， 即制得Cu.TPA。
2.2.2 金纳米颗粒的合成 参照文献[23]合成金纳米颗粒。将 500 μL 1% HAuCl4 加入到50 mL 去离子水中，搅拌加热至沸腾，快速向沸腾溶液中加入2 mL 1%柠檬酸三钠，继续搅拌20 min，等到溶液变为酒红色，冷却至室温，即可得到金纳米颗粒。
2.2.3 AuNPs/Cu.TPA复合材料的合成 取50 mg Cu.TPA粉末溶于15 mL金纳米颗粒溶液中，室温搅拌12 h，溶液由蓝色变为淡粉色。将反应产物离心分离，60℃真空干燥6 h。
2.2.4 AuNPs/Cu.TPA复合材料标记CEA抗体 取2 mg AuNPs/Cu.TPA复合材料溶于1 mL去离子水中，用0.2 mol/L Na2CO3调节溶液至pH 9，取10 μL 1 mg/mL CEA抗体分5次加入（每隔3 min加一次，每次2 μL ）上述溶液中进行标记，然后将溶液在室温下振摇反应2 h ，加入10% BSA 25 μL，继续振摇反应30 min 以封闭剩余的活性位点。将所得溶液以5000 r/min低温离心5 min，用PBS溶液洗涤2次，分散在1 mL Eluent 缓冲溶液中，4℃保存备用。
2.2.5 免疫传感器的制备 将玻碳电极（Φ=3 mm）在金相砂纸上打磨后，用 Al2O3粉末将电极表面抛光，依次用HNO3（1∶1）、无水乙醇、蒸馏水各超声洗涤电极5 min。晾干后，参照文献[24] 方法还原氧化石墨烯，即将玻碳电极浸入到含有氧化石墨烯的电解质溶液中，通过循环伏安法，将分散液中的氧化石墨烯直接进行电化学还原并沉积在裸电极表面，电压扫描范围为
1.5～1.0 V。在晾干后的沉积有还原石墨烯（rGO）的电极上滴加30 μg/mL CEA抗体10 μL，4℃过夜。将此免疫传感器用0.01 mol/L PBS溶液滴洗3次，晾干后在37℃下用牛血清白蛋白（1% BSA） 封闭1 h，以封闭电极上的非特异性结合位点。滴加一定浓度的CEA抗原孵育50 min，冲洗后滴加10 μL AuNPs/Cu.TPA复合材料标记过的CEA抗体培育50 min，制得免疫传感器（见图2）。
2.2.6 检测方法 将在不同浓度CEA抗原溶液中培育过的免疫传感器放入10 mL HAc.NaAc缓冲溶液（0.2 mol/L， pH 4.5）中，连接好三电极体系，在0.3～
0.4 V电位范围内采用示差脉冲伏安法（DPV）进行检测，振幅50 mV， 脉冲时间0.05 s，脉冲周期0.2 s。实验结束后， 用0.01 mol/L PBS清洗电极，并置于4 mol/L尿素溶液中搅拌浸泡30 min， 洗脱电极上结合的抗原，使电极再生。当电极不用时，于4℃保存。
3 结果与讨论
3.1 Cu.TPA材料的表征
3.1.1 Cu.TPA材料的XRD表征 对合成的Cu.TPA材料进行了X射线粉末衍射表征， 并与文献[18]及XRD数据库所得的Cu.TPA单晶数据图进行对比，如图3所示。得到的衍射面数据分别为（110）， （001）， （020）， （11， （20
1）， （021）， （111）， （130）， （131）。经过实验值计算，证实本实验所合成的材料Cu.TPA与文献[18]报道的一致，为MOF材料。
3.1.2 Cu.TPA微观形貌表征 采用扫描电镜、透射电镜表征了Cu.TPA的微观形貌结构。从图4可见，Cu.TPA呈均匀的棒状，长度约为200 nm。
3.1.3 Cu.TPA/AuNPs材料的表征 为了确定AuNPs/Cu.TPA的微观形貌结构，采用TEM对其形貌进行了表征。从图5可以清晰看出AuNPs被均匀地负载到 Cu.TPA材料上。
3.2 氧化还原峰电流与扫描速度的关系
为进一步了解AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫传感器的电化学行为，实验还考察了扫描速度对AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE的峰电流的影响，当扫描速度在10～100 mV/s 范围内变化时，传感器在HAc.NaAc缓冲溶液 （0.2 mol/L，pH 4.5）中的循环伏安行为如图6所示，峰电流与扫描速度的平方根成正比，说明该电化学反应过程受扩散控制，这可能是因为在合成Cu.TPA过程中，Cu的价态发生了改变。然而，阴极峰电流较小，说明此电化学过程是不可逆的[25]。
3.3 不同修饰电极界面的交流阻抗行为
交流阻抗常被用于表征电极修饰过程。
图7为不同修饰电极在5 mmol/L K3Fe（CN） 6/K4Fe（CN） 6溶液中的交流阻抗图。曲线a为裸玻碳电极的阻抗图，近似呈直线，说明电子传递几乎没有阻碍；
曲线b为修饰了石墨烯后玻碳电极的阻抗图，阻抗改变很小。曲线c为固定抗体在修饰了石墨烯的玻碳电极上的阻抗图，阻抗有所增加（R et=500 Ω），这是由于不导电的抗体阻碍了电子在电极表面的传递，说明抗体已固定在电极表面上。曲线d是培育CEA抗原后的电极的交流阻抗图，与曲线c相比，半圆直径显著增大（R et=700 Ω），这是由于抗体和抗原的特异性结合阻碍了电子的传递。曲线e是培育了AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA之后的电极交流阻抗图，阻抗值进一步增大（R et=1450 Ω），这说明免疫复合物对电子的阻碍作用增强。
3.4 实验条件优化
3.4.1 缓冲溶液pH值对传感器峰电流的影响 溶液的pH值会影响标记材料中Cu的峰电流信号，从而影响免疫传感器的检测，实验考察了pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的HAc.NaAc缓冲溶液对标记抗体材料中Cu的峰电流响应的影响。如图8所示，当pH值从3.0增加到4.5，还原峰电流也随之增加；
pH值继续增加，还原峰电流反而减小，在pH 4.5时，免疫传感器的电流响应值最大。故选择pH 4.5的HAc.NaAc缓冲溶液作为最佳测试底液。
3.4.2 固定抗体的浓度对传感器峰电流的影响 固定抗体浓度是影响免疫传感器灵敏度和检测范围的重要因素，实验对固定抗体浓度进行了优化，浓度优化范围为10～60 μg/mL，结果如图9所示，随着固定抗体浓度增大，传感器的响应电流逐渐增大，当抗体浓度达到30 μg/mL时，响应电流最大，继续增大浓度。响应电流有所减小。因此选择30 μg/mL作为最佳固定抗体浓度。
3.4.3 抗原培育时间和标记抗体培育时间对传感器峰电流的影响 为了考察抗原培育时间对免疫传感器响应电流的影响，采用不同时间培育10 ng/mL CEA抗原， 测定传感器的响应电流值，结果如图10a所示， 响应电流随抗原培育时间延长而增大，50 min以后响应电流近似平台，因此选择50 min作为最佳抗原培育时间。标记抗体培育时间也是影响免疫传感器的重要因素，将修饰有相同浓度抗原的免疫传感器在37℃的条件下采用不同时间培育标记抗体，结果如图10b所示， 20～50 min，传感器响应电流的绝对值随着培育时间的延长而逐渐增大；
50～60 min， 电流基本不变，出现平台，说明此时CEA抗原和AuNPs/Cu.TPA标记的CEA抗体结合形成了稳定的复合物。因此，最佳标记抗体的培育时间选择为50 min。
3.5 免疫传感器的校正曲线 在最佳实验条件下，获得了传感器对不同浓度的CEA响应的曲线。从图11可见，AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫传感器的峰值电流随CEA浓度的增加而增大，峰电流在0.1～80 ng/mL范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为0.9887，检出限为0.03 ng/mL， 正常人体内CEA含量为0～25 ng/mL， 所以此CEA免疫传感器可用于真实样品的检测。
比较了几种检测CEA方法的性能。从表1可知，本研究制备的传感器具有较高的灵敏度、良好的线性范围和较低的检出限。
3.6 免疫传感器的选择性
选择200 ng/mL的丙氨酸（Ala）、C.反应蛋白（CRP）和人绒毛促性腺激素（HCG）以及BSA（1%）作为干扰物质，与40 ng/mL CEA的响应电流作对比，检测传感器的抗干扰情况。如图12所示，在相同条件下，丙氨酸、BSA（1%）、CRP和HCG的浓度远大于CEA，但所得响应电流较小，说明丙氨酸、BSA（1%）、CRP和HCG对CEA的检测基本不造成干扰，传感器对CEA具有较高的选择性。
3.7 回收率的测定
采用标准加入法，对CEA免疫传感器进行回收测定。在血清样品中加入3种不同浓度的
CEA抗原，按本方法进行测定，平均回收率为97.5%～102.7%（表2），结果令人满意，说明此传感器可用于实际样品中CEA含量的测定。
3.8 免疫传感器的稳定性
为了考察免疫传感器的稳定性，将所制备的免疫传感器检测一次后置于4℃保存，分别在7、15、30天后再次对相同浓度的CEA抗原进行检测， 测得的电流I与初始电流I0的比值7天后下降到98%，15天后下降到87%，30天后下降到66%， 表明此传感器的稳定性良好。4 结 论
采用还原石墨烯作为固定基质，研制了一种新型CEA免疫传感器，并用于血清中CEA的检测。合成了Cu.TPA/AuNPs复合材料，此材料中的Cu在一定的电位范围内可以通过DPV直接检测到，以Cu.TPA/AuNPs复合纳米材料为标记材料，制备了夹心型CEA免疫传感器。此传感器具有成本低、灵敏度高，抗干扰能力强，检出限低等特点。将此传感器用于测定血清样品中的CEA，结果令人满意。
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抗疫交流材料范文第2篇
关键词：高致病性猪蓝耳病：ELISA；
血清学调查
高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，是目前引起母猪繁殖和仔猪呼吸道疾病的重要病原之一，很难清除和净化，临床上该病具有传播快、高温、病死率高、治愈率低的特点，成为威胁猪群健康的主要传染病之一。PRRS本身具有较强的感染性，可经多种途径感染猪。PRRS的流行病学研究表明，PRRS特殊的致病机理及传播途径多样是其广泛传播的主要原因，为摸清冀鲁豫（河北、山东、河南）三省交接地区对该病的免疫水平，科学评估不同规模猪场猪瘟高致病性猪蓝耳病疫苗的免疫效果，2012年1月至2014年12月，笔者对冀鲁豫三省交接地区不同规模猪场3年间高致病性猪蓝耳病进行了免疫抗体水平检测，被检测的所有猪场防疫条件相对较好，猪群均健康，没有发生过高致病性猪蓝耳病。现将有关检测结果报告如下。
1.材料与方法
1.1试验材料
被检血清均来自冀鲁豫三省交界地区的不同规模猪场，其中2012年血清样品835份，2013年血清样品1 268份，2014年血清样品726份。
1.2试验方法
待测血清样品按照猪繁殖与呼吸综合征检测试剂盒说明书进行操作。
2.结果与分析
由表1可知，2012、2013、2014年三年间该地区母猪高致病性猪蓝耳病抗体合格率分别为82.8%、80.2%、75.0%；
断奶前仔猪抗体合格率分别为77.7%、71.2%、70.9%；
断奶后仔猪抗体合格率分别为70.0%、50.9%、28.8%；
育肥猪抗体合格率分别为25.7%、24.9%、21.7%；
总体抗体合格率呈逐年下降的趋势。根据表2、表3可看出，不同饲养规模的猪场高致病性猪蓝耳病免疫抗体合格率有所不同，2012年、2013年、2014年500头以上猪场母猪抗体合格率分别为88.4%、81.9%、72.2%；
断奶前仔猪体合格率分别为85.3%、72.2%、65.5%；
断奶后仔猪抗体合格率分别为84.8%、58.7%、34.6%；
育肥猪抗体合格率分别为30.8%、34.5%、14.8%；
从总体的比较结果来看，规模500头以上猪场普遍比规模在500头以下的猪场的高致病性猪蓝耳病免疫抗体合格率高一些。
3.讨论
从检测结果来看，不同生长阶段猪高致病性猪蓝耳病免疫抗体合格率不尽相同，无论是存栏在500头以上的猪场还是存栏500头以下的猪场，普遍存在母猪高致病性猪蓝耳病免疫抗体合格率要比断奶前后仔猪、育肥猪高：断奶前仔猪免疫抗体合格率普遍高于断奶前后仔猪、育肥猪，其中育肥猪的免疫抗体合格率最不理想，总体合格率普遍在30%以下。母猪抗体合格率高应该是饲养水平相对较好，并且母猪免疫高致病性猪蓝耳病次数较多的原因。因为母源抗体存在的因素，所以断奶前仔猪的抗体合格率相对较高，但是断奶后，随着母源抗体水平的下降，抗体合格率逐渐下降，对猪体的保护率也随之降低，发生高致病性猪蓝耳病的风险也在加大，尤其是育肥猪抗体水平难以起到保护作用，发病风险更大。因此，合理确定高致病性猪蓝耳病的首次免疫和加强免疫，确保断奶后仔猪具有较高的抗体水平是当前高致病性猪蓝耳病免疫工作的重点内容之一。
2012年、2013年存栏500头以上猪场的猪群的高致病性猪蓝耳病抗体合格率均高于500头以下猪场的猪群，这应该与大规模养殖场饲养管理水有关。但在2014年则出现了500头以下的猪场母猪、断奶前仔猪、断奶后仔猪、育肥猪免疫抗体水平都比500头以上的猪场高。笔者调查发现，在被检测的500头以上的个别规模猪场中不同程度感染了猪瘟等疫病，导致高致病性猪蓝耳病免疫抗体水平相对较低。另外，而被检测的500头以下的猪场近几年更加注重综合防控措施的落实，没有其他传染病发生，猪场正常生产没有受到影响。
抗疫交流材料范文第3篇
为做好我县畜牧业抗灾救灾工作，确保畜牧业生产正常有序开展，特制定本意见。
一、畜牧业抗灾的目标和任务
总体目标是：做好灾区畜牧业生产恢复工作，最大限度的将我县畜牧业损失降到最低，力争在1个月内全面恢复种畜禽和商品畜禽生产能力，努力实现灾后生猪、家禽等生产的健康、稳定发展。
重点工作任务是：
（一）加固修缮灾区畜禽圈舍。制定灾后畜禽圈舍修建方案，抓紧时间修复重建畜禽圈舍，为畜禽正常生长创造必要的饲养条件。
（二）加强灾后畜禽饲养管理。针对我县畜禽品种多、饲养模式众多不一的情况，引导养殖场（户）加强科学饲养管理。帮助解决损失严重的养殖场（户）及时进行补栏。
（三）加强动物疫病防控。全面开展消毒灭源工作，及时实施补免，强化重大动物疫病监测，及时掌握疫情动态和畜禽抗体水平，确保灾后不发生重大动物疫病。
（四）加强技术指导。组织专家和技术人员深入一线，送科技下乡，帮助农民开展科技救灾，及时恢复畜牧生产。
（五）加强信息服务工作。及时给养殖场（户）提供市场供求信息、饲料原料供应信息等，积极为灾区调配畜禽种苗，保证灾区所需疫苗、饲料、兽药等物资供应。
二、灾后恢复畜牧业生产的技术方案
（一）生猪生产灾后恢复技术措施
1、猪舍重建。按照生猪生产技术规范要求尽量采用水泥结构栏舍，适当增加屋顶人字架的密度和强度，增强抵御大风暴雨的坚固度；
采用纵向通风技术，猪舍进出风口可自动或人工调节；
做好猪舍尤其产房、保育舍的控温设计，既要满足夏季防暑降温，也要考虑冬季保温的需要。及时清理猪粪，保持猪舍清洁、干燥、舒适，利于生猪生长。
2、科学配制饲料与饲养。提高饲料能量水平。在保持蛋白质水平不减的情况下，增加能量饲料10%-30%，必要时添加2%-3%的动植物油；
在饲料中添加具有抗应激、抗氧化能力的维生素、氨基酸等饲料添加剂，通过营养调控，提高猪的抗病力和抗逆性；
饲喂要定时、定量、定温、定质。
3、加强生猪疫病综合防治。严禁外来人员自由进出猪场，防治外来疫源传入；
即将进入夏季高温季节，做好夏季猪病的防控工作，特别是高致病性猪蓝耳病和“高热病”的防控工作；
加强猪群健康水平监测，及时做好补免工作；
出现异常的生猪要立即采用有效措施进行隔离、治疗、甚至扑杀处理，防止疫情扩散；
按照生产实际需要，合理调整免疫程序，防止因免疫过度引起免疫系统紊乱、无法产生抗体现象的出现；
做好猪场的消毒和猪群保健工作，重点是母猪产前一周和仔猪断奶前后一周的护理。
（二）家禽生产灾后恢复技术措施
1、抢修加固鸡舍。对因受灾损毁的鸡舍进行及时加固抢修，排查检修电路，整修挖深鸡舍周围的排水沟，新建鸡舍要要按照技术规范要求选择南向平坦或稍有坡地的地方，远离交通要道及居民区，尽量做到利于防疫和减少对附近居民的影响。
2、选择良种。根据当地生产条件和市场需求，从证照齐全、生产管理水平较高的种鸡场，引进优质黄羽肉鸡和快大型白羽肉鸡品种，及时补栏，特别是要恢复种禽场的生产能力。
3、适时调整日粮组成。种鸡和未到上市日龄的肉鸡要提高其日粮能量浓度要求提高日粮能量浓度和增加饲料喂量，如可增加玉米10%-20%用量。
4、强化生物安全措施。按照免疫程序适时进行免疫接种，特别是高致病性禽流感和新城疫的免疫接种，密切监测抗体水平和鸡群健康动态，对抗体水平较低的鸡群要进行及时补免，及时淘汰处理伤残鸡。对死鸡必须采用抛洒生石灰深坑填埋或焚烧等方式进行无害化处理，防止疫病传播。
5、加强饲养管理。夏季高温天气要减少育成鸡室外运动量，适当降低饲养密度，注意禽舍的通风换气，保持空气新鲜。饮水或饲料中补充多维、电解质等保健、抗应激药物，以增强鸡只的抵抗力，减少疾病的发生。
（三）牛羊灾后恢复技术措施
1、尽快修复畜舍。修复因风灾严重损坏的畜舍，要特别注意畜舍顶棚的坚固性，采用隔热材料，注意高温季节的降温，可设置易于拆卸的挡风遮阳材料，如草帘、帆布帘等。
抗疫交流材料范文第4篇
随着我国畜禽养殖业的迅速发展和兽药研究的不断发展,抗生素在畜禽各种疾病感染治疗上的应用已形成普遍,但由于生理环境、抗生素滥用、交叉耐药性和疫苗接种失活等,使畜禽机体免疫力大大下降,产能下降,加上药物的残留,使一些动物源食品对人们的健康直接带来危害,成为健康人生的最大瓶颈,随着贵重药材的日渐频临灭绝和严重短缺的事实,使一些稀有中药材变得昂贵并受到保护,中国是一个中药大国,具有两千多年的历史,如何更好的使用中药材,发挥中国中药特色,更好的为畜禽养殖者服务,人类健康服务,始终是国家和全民关注的话题。
一、立项背景
人参具有大补元气、复脉固脱,补脾益肺,生津,安神的作用,而以人参茎叶为原料,采用提取、浓缩、醇沉、超滤、精制、液质联用、液液联用等技术,提取有效成分人参茎叶皂苷,经沸腾干燥、喷雾干燥得到的人参茎叶皂苷同样具有人参的活性和功能,这样可减少稀有贵重中药材的使用,降低了大量野用人参和人工种植人参的利用,增加了新药源。通过将流化床技术、靶向技术、速释技术和控释技术将人参茎叶皂苷制成不同的剂型,如散剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、口腔速释片和冻干粉针等剂型,增加新药源新剂型的开发和使用,使人参茎叶皂苷总成分更有效的得到发挥,使药效与人参相同并且大大降低了成本,增加机体免疫力,增加机体抗疾病能力,减少药物和抗生素的使用,利国利民。
二、国内外市场调研、产品地位
人参茎叶皂苷提取技术已用于人药,但兽药尚未有研究、开发和使用,人参茎叶皂苷的制剂如散剂、颗粒剂、片剂、口服液、冻干粉针等国内尚未有该产品的研制、开发、生产和上市,因此我公司自主创新成功研制了人参茎叶皂苷及其系列产品,弥补了国内外兽药市场的空白,增加了贵重药材的新药源,为增强畜禽机体免疫力和抗疾病能力开辟了新途径,实现了健康畜禽的最大设想。该原料和制剂产品具有安全、高效、绿色、无残留、给药途径方便的重大特点,为国内目前首家首次研制成功。
三、功能与主治:
具有大补元气、复脉固脱,补脾益肺,生津,安神,有效提升机体免疫力,预防耐药性,增加抗疾病能力,提高抗应激能力,促进机体快速恢复。
该提取物可和其它中药原药材、中药提取物等联合配伍使用,也可作为畜禽的保健产品和功能药物。
四、产品特点、产品优势:
1、作用广泛:本品吸收迅速,生物利用度高达92%以上,对各种病原和不恰当药物使用造成
的免疫抑制状态均有明显疗效。
2、标本兼治:本品配方独特,能迅速缓解症状,快速恢复食欲、控制死亡,不易产生耐药性,
复发率低,疗效确切彻底。
3、以中西医理论为依据,遵循中药西制的原则,合理使用原料,采用液液提取、浓缩、醇沉、超滤精制、液质联用、液液联用、沸腾干燥、流化床靶向技术、喷雾干燥、中药指纹图谱检测技术等现代中医药技术,提取有效成分和单体,确保剂量准确、质量可控、用药安全有效。
4、安全、高效、绿色、无残留、给药途径方便,可供所有畜禽出口专用。
5、国内首家独创,技术领先。
五、发明专利
人参茎叶皂苷提取物提取精制超滤制备工艺及其散剂、颗粒剂、速释片剂、胶囊剂、口服液、冻干粉针已申请了发明专利,获得了中华人民共和国国家知识产权申请号,并通过了首次专家审评和一致性通过。
抗疫交流材料范文第5篇
【关键词】 抗CK20单克隆抗体；
SPASepharose；
杂交瘤技术；
Western Blot；
ELISA
0引言
研究CK20表达用于诊断和评估膀胱肿瘤，已成为国内外研究热点之一. 但目前国内的抗CK20 mAb一直依赖进口，价格昂贵且不便运输，严重影响其推广应用和研究. 我们于2002年成功地从膀胱癌T24细胞系中提取CK20抗原［1］，我们采用CK20抗原通过杂交瘤技术制备抗CK20 mAb，为进一步研制CK20 mAb胶体金试剂盒筛查膀胱癌奠定基础.
1材料和方法
1．1材料
①动物及试剂 BALB/c小鼠购自第三军医大学动物中心，鼠龄6~12 wk，体质量18~22 g，雌雄不限；
CK20抗原为本实验室纯化所得；
Freund氏完全佐剂和不完全佐剂及HAT培养基为Gibco产品；
SP2/0骨髓瘤细胞来自中国预防医学科学院病毒研究所；
细胞融合剂PEG4000为Mereck产品，SPASepharose CL4B为Pharmacia产品；
IgA， IgM， IgG1， IgG2a， IgG2b及IgG3蛋白均为Sigma产品. ②仪器 国产96孔和24孔培养板、超净工作台；
德国Heraeus离心机，BioRad公司550酶标仪、电泳仪、转膜系统及凝胶成像分析系统；
德国LKB层析系统；
Olympus倒置显微镜.
1.2方法
1.2．1动物免疫及脾细胞收集免疫方法参照文献［2］，共免疫3只小鼠，免疫后用琼脂扩散法检测小鼠血清产生抗体情况，选高效价者剪颈放血取脾，收集脾细胞，并作100 g/L台盼蓝染色，同时收集血液，分离血清供测定抗体滴度用.
1.2．2细胞融合及杂交瘤细胞选择性培养参照文献［2］进行，以HAT为培养液，滴加到已铺有饲养细胞96孔培养板中，置50 mL/L CO2培养箱中培养.
1.2．3阳性克隆筛选及克隆化培养以CK20抗原包被酶标板微孔，采用间接ELLSA法检测所有生长孔的培养上清液，并分别以小鼠多抗血清和PBS做阳性和阴性对照，经酶标仪测定A490 nm值，以等于或大于对照2.1倍为阳性. 阳性孔采用有限稀释法进行细胞克隆化. 克隆化培养1 wk后采用ELISA法检测有细胞克隆化生长的所有孔上清液，阳性者及时部分冻存，部分扩大培养. 待克隆长至孔底面积的1/3~2/1时，转至24孔扩大培养.
1.2．4杂交瘤细胞核型分析方法同外周血淋巴细胞染色体制作［3］，最后于油镜下计数20个分散较好且完整的中期分裂相.
1.2．5腹水抗体的制备及抗体含量测定共选择10只体健BALB/C小鼠，每只腹腔接种医用石蜡油0.5 mL，12 d后每只腹腔接种6×106个已克隆化细胞（约0.5 mL）. 2 wk后有明显腹水产生时剪颈处死，分别收集血液和腹水，1000 r×10 min，取上清，-20℃保存. 并采用Bradford assay法测定抗体含量.
1.2．6mAb纯化采用本实验室建立的方法纯化CK20 mAb［4］.
1.2．7mAb特性分析①mAb特异性鉴定 用Western Blot法，以纯化所得CK20 mAb作一抗与体外培养的膀胱肿瘤T24细胞行免疫印记试验，并以CK20抗原做对照. 将培养细胞裂解，离心，取上清用于SDSPAGE电泳，转膜后加CK20 mAb反应，显色，凝胶成像分析系统分析. ② mAb Ig类型及亚型鉴定 采用双向琼脂免疫扩散法［5］，将杂交瘤细胞培养上清液离心并浓缩10~20倍，加样于20 g/L琼脂中，分别加标准IgG， IgG1， IgG2a，IgG2b，IgA和IgM进行双向免疫扩散，将加样后琼脂板放入湿盒，置37℃水浴箱中24 h后观察结果. ③抗体效价检测 采用间接ELISA法，同时测定细胞培养上清液，免疫小鼠血清多抗，腹水mAb和纯化mAb效价.
2结果
通过测定被免疫小鼠的尾血发现，3只小鼠血清与CK20抗原均在琼脂管中相互扩散而形成一条抗原抗体结合线. 最后一次免疫72 h后，剪颈放血取脾，收集脾细胞，共获5×106脾细胞，台盼蓝染色后不着色细胞约占97%. 细胞融合后接种于2块96孔培养板中，共接种192孔，第15日时可见40孔有细胞生长，占20%. ELISA测定结果发现有8个阳性孔，占生长孔的20%. 取阳性克隆孔细胞株采用有限稀释法进行4次克隆化，每次接种60孔，其中有一株细胞（CK206）随着克隆次数增多，抗体阳性细胞生长孔从66%增至100%(表1)，选定细胞形态较好的细胞生长孔进行扩大培养和冻存，并命名为L20031030.表1杂交瘤细胞株克隆化结果(略)
小鼠脾脏淋巴细胞染色体众数为40，SP2/0为62~68，故杂交瘤细胞标记染色体众数应为99~108，本分析结果可见染色体众数为99~103，说明CK206细胞株是脾细胞和骨髓瘤细胞的融合体(图1).
Western Blot结果显示，纯化的CK20抗原及T24细胞裂解液均和CK206 mAb反应，在Mr为45.0×103附近显示出一条很浓的免疫印记带.说明CK206 mAb具有较高的特异性（图2）.
与IgG和IgG1之间形成一条沉淀线，故说明CK20 mAb属IgG1亚型.
三种成分的抗体效价分别是：培养上清液效价为1∶102，血清多抗效价为1∶103，腹水mAb和纯化mAb效价均为1∶106; 三个不同pH的0.1 mol/L枸橼酸洗脱时，分别收集20 mL；
双向琼脂扩散法鉴定证实pH 6.0洗脱液为IgG1；
Bradford assay法测定抗体浓度为1.44 g/L.
3讨论
膀胱肿瘤的诊断在临床上主要依靠膀胱镜加活检，其损伤性较大，患者难以接受. CK20在膀胱肿瘤细胞中具有独特的表达特性［6］，利用mAb可以通过免疫学法监测CK20表达来评价膀胱肿瘤，其特异性高，方法简单，结果较可靠. 我们于2002年纯化获得了CK20抗原，并进行了鉴定.杂交瘤技术是制备mAb传统而成熟方法，又不断得到改进. 我们根据本实验室经验和条件，结合试验具体情况对各个环节加以优化，如免疫剂量、方法和时间等，三只小鼠免疫后均产生了较强的抗体滴度，证实免疫是成功的.
细胞融合后要对融合效果进行鉴定，一般采用染色体分析. 本次分析结果可见杂交瘤标记染色体（众数为99~103），说明CK206细胞株是脾细胞和骨髓瘤细胞的融合体.
mAb的纯化方法较多，但最有效的方法尚属亲和色谱法，其方法效果好，回收率高达90％以上. 本研究我们利用SPA和Sepharose交联制成亲和层析柱，以不同的0.1 mol/L枸椽酸缓冲液为流动相，通过改变流动相pH值可将不同类型抗体逐级洗脱下来，如pH 6.0洗脱IgG1，pH 4.0洗脱IgG2a，pH 3.0洗脱IgG2b等，从对三组洗脱峰的鉴定来看，pH 6.0时所洗脱下来的抗体确是IgG1. 抗体纯化后要进行活性鉴定，从免疫印记结果看Mr为45.0×103附近出现一条很浓的抗原抗体杂交带，证明了CK206 mAb具有很强的特异性和活性.
参考文献
［1］ 刘彦慧，罗春丽，吴小候，等.膀胱肿瘤T24细胞系中CK20纯化及鉴定［J］. 第三军医大学学报，2005，27（4）：302-305.
［2］ 王永杰，齐名，李保仝，等.抗克论特罗单克隆抗体杂交瘤的建立及其分泌单抗的免疫学特性鉴定［J］. 免疫学杂志，2004，20（3）：194-198.
［3］ 许艇，邵晓龙，秦治翔，等.杀虫剂西维因单克隆抗体的研制及鉴定［J］. 免疫学杂志，2004，20（1）：61-64.
［4］ 刘彦慧，罗春丽，吴小候，等. 细胞角蛋白单克隆抗体纯化方法的探讨［J］. 中国医学检验杂志，2005，6（1）:17-18.
［5］ 杨斌，何杨，赵益明，等. 抗人白细胞单克隆抗体的特异性及特异性鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2002，18（2）：158-160.
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